Dithiothreitol (DTT) ialah agen pengurangan yang biasa digunakan, juga dikenali sebagai aditif hijau baharu.Ia adalah sebatian organik molekul kecil dengan dua kumpulan merkaptan (-SH).Disebabkan sifat pengurangan dan kestabilannya, DTT digunakan secara meluas dalam eksperimen biokimia dan biologi molekul.
Peranan utama DTT adalah untuk mengurangkan ikatan disulfida dalam protein dan biomolekul lain.Ikatan disulfida adalah bahagian penting dalam lipatan dan kestabilan protein, tetapi di bawah keadaan eksperimen tertentu, seperti analisis SDS-PAGE yang boleh dikurangkan, penggabungan semula protein dan lipatan, adalah perlu untuk mengurangkan ikatan disulfida kepada dua kumpulan tiol untuk membongkar struktur spatial protein itu.DTT boleh bertindak balas dengan ikatan disulfida untuk mengurangkannya kepada kumpulan merkaptan, sekali gus membuka struktur spatial protein dan menjadikannya mudah untuk dianalisis dan dimanipulasi.
DTT juga boleh digunakan untuk melindungi aktiviti dan kestabilan enzim.Dalam beberapa tindak balas pemangkin enzim, aktiviti enzim mungkin dikurangkan oleh pengoksida.DTT boleh bertindak balas dengan oksidan untuk mengurangkannya kepada bahan yang tidak berbahaya, dengan itu melindungi aktiviti dan kestabilan enzim.
Berbanding dengan agen penurunan tradisional seperti β-mercaptoethanol (β-ME), DTT dianggap sebagai agen penurunan yang lebih selamat dan lebih stabil.Ia bukan sahaja stabil dalam larutan akueus, tetapi juga mengekalkan sifat pengurangannya di bawah suhu tinggi dan keadaan asid-bes.
Penggunaan DTT agak mudah.Secara amnya, DTT dibubarkan dalam penimbal yang sesuai dan kemudian ditambah kepada sistem eksperimen.Kepekatan optimum DTT perlu ditentukan mengikut eksperimen khusus, dan biasanya digunakan dalam julat 0.1-1mM.Kepekatan yang lebih rendah boleh mengurangkan kesan buruk terhadap pertumbuhan sel dan boleh mengurangkan sitotoksisiti akibat ekspresi berlebihan protein sasaran.Kepekatan yang lebih tinggi boleh menyebabkan beban metabolik sel yang berlebihan, menjejaskan pertumbuhan sel dan kecekapan ekspresi.
Cara untuk menentukan kepekatan optimum adalah dengan menilai tahap ekspresi protein sasaran dengan menjalankan ujian induksi IPTG pada kepekatan yang berbeza.Ujian kultur berskala kecil boleh dilakukan menggunakan julat kepekatan IPTG (cth 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, dsb.) dan kesan ekspresi pada kepekatan yang berbeza boleh dinilai dengan mengesan tahap ekspresi protein sasaran (cth Barat pengesanan blot atau pendarfluor).Mengikut keputusan eksperimen, kepekatan dengan kesan ekspresi terbaik dipilih sebagai kepekatan optimum.
Di samping itu, anda juga boleh merujuk kepada literatur yang berkaitan atau pengalaman makmal lain untuk memahami julat kepekatan IPTG yang biasa digunakan di bawah keadaan eksperimen yang serupa, dan kemudian mengoptimumkan dan menyesuaikan mengikut keperluan eksperimen.
Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kepekatan optimum mungkin berbeza-beza bergantung pada sistem ekspresi yang berbeza, protein sasaran dan keadaan eksperimen, jadi yang terbaik adalah untuk mengoptimumkan berdasarkan kes demi kes.
Ringkasnya, DTT ialah agen penurunan yang biasa digunakan yang boleh digunakan untuk mengurangkan ikatan disulfida dalam protein dan biomolekul lain dan untuk melindungi aktiviti dan kestabilan enzim.Ia telah digunakan secara meluas dalam biokimia dan eksperimen biologi molekul.
Masa siaran: Sep-28-2023