Ditiotreitol (DTT) ialah agen penurunan yang biasa digunakan, juga dikenali sebagai bahan tambahan hijau baharu. Ia merupakan sebatian organik molekul kecil dengan dua kumpulan merkaptan (-SH). Disebabkan sifat penurunan dan kestabilannya, DTT digunakan secara meluas dalam eksperimen biokimia dan biologi molekul.
Peranan utama DTT adalah untuk mengurangkan ikatan disulfida dalam protein dan biomolekul lain. Ikatan disulfida merupakan bahagian penting dalam pelipatan dan kestabilan protein, tetapi di bawah keadaan eksperimen tertentu, seperti analisis SDS-PAGE yang boleh dikurangkan, penggabungan semula protein dan pelipatan, adalah perlu untuk mengurangkan ikatan disulfida kepada dua kumpulan tiol untuk menguraikan struktur ruang protein. DTT boleh bertindak balas dengan ikatan disulfida untuk mengurangkannya kepada kumpulan merkaptan, sekali gus membuka struktur ruang protein dan memudahkannya untuk dianalisis dan dimanipulasi.
DTT juga boleh digunakan untuk melindungi aktiviti dan kestabilan enzim. Dalam beberapa tindak balas yang dimangkinkan oleh enzim, aktiviti enzim boleh dikurangkan oleh pengoksida. DTT boleh bertindak balas dengan pengoksida untuk mengurangkannya kepada bahan yang tidak berbahaya, sekali gus melindungi aktiviti dan kestabilan enzim.
Berbanding dengan agen penurunan tradisional seperti β-merkaptoetanol (β-ME), DTT dianggap sebagai agen penurunan yang lebih selamat dan lebih stabil. Ia bukan sahaja stabil dalam larutan akueus, tetapi juga mengekalkan sifat penurunannya di bawah suhu tinggi dan keadaan asid-bes.
Penggunaan DTT agak mudah. Secara amnya, DTT dilarutkan dalam penimbal yang sesuai dan kemudian ditambah ke dalam sistem eksperimen. Kepekatan DTT yang optimum perlu ditentukan mengikut eksperimen khusus, dan biasanya digunakan dalam julat 0.1-1mM. Kepekatan yang lebih rendah dapat mengurangkan kesan buruk terhadap pertumbuhan sel dan dapat mengurangkan sitotoksisiti akibat ekspresi berlebihan protein sasaran. Kepekatan yang lebih tinggi boleh menyebabkan beban metabolik sel yang berlebihan, yang menjejaskan pertumbuhan sel dan kecekapan ekspresi.
Cara untuk menentukan kepekatan optimum adalah dengan menilai tahap ekspresi protein sasaran dengan menjalankan ujian induksi IPTG pada kepekatan yang berbeza. Ujian kultur berskala kecil boleh dilakukan menggunakan julat kepekatan IPTG (contohnya 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, dsb.) dan kesan ekspresi pada kepekatan yang berbeza boleh dinilai dengan mengesan tahap ekspresi protein sasaran (contohnya Western blot atau pengesanan pendarfluor). Menurut keputusan eksperimen, kepekatan dengan kesan ekspresi terbaik dipilih sebagai kepekatan optimum.
Di samping itu, anda juga boleh merujuk kepada literatur yang berkaitan atau pengalaman makmal lain untuk memahami julat kepekatan IPTG yang biasa digunakan di bawah keadaan eksperimen yang serupa, dan kemudian mengoptimumkan dan menyesuaikannya mengikut keperluan eksperimen.
Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kepekatan optimum mungkin berbeza-beza bergantung pada sistem ekspresi yang berbeza, protein sasaran dan keadaan eksperimen, jadi adalah lebih baik untuk dioptimumkan berdasarkan kes demi kes.
Secara ringkasnya, DTT ialah agen penurunan yang biasa digunakan yang boleh digunakan untuk mengurangkan ikatan disulfida dalam protein dan biomolekul lain serta untuk melindungi aktiviti dan kestabilan enzim. Ia telah digunakan secara meluas dalam eksperimen biokimia dan biologi molekul.
Masa siaran: 28 Sep-2023