IPTG (isopropil-β-D-tiogalactoside) ialah analog substrat β-galaktosidase, yang sangat boleh diinduksi. Di bawah induksi IPTG, inducer boleh membentuk kompleks dengan protein penindas, supaya konformasi protein penindas berubah, supaya ia tidak boleh digabungkan dengan gen sasaran, dan gen sasaran diekspresikan dengan cekap. Jadi, bagaimanakah kepekatan IPTG harus ditentukan semasa eksperimen? Adakah lebih besar lebih baik?
Pertama sekali, mari kita fahami prinsip induksi IPTG: Operon laktosa (unsur) E. coli mengandungi tiga gen struktur, Z, Y, dan A, yang masing-masing mengekod β-galaktosidase, permease, dan asetiltransferase. lacZ menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, atau menjadi alo-laktosa; lacY membenarkan laktosa dalam persekitaran melalui membran sel dan memasuki sel; lacA memindahkan kumpulan asetil daripada asetil-CoA kepada β-galaktosida, yang melibatkan penyingkiran kesan Toksik. Di samping itu, terdapat jujukan operasi O, jujukan permulaan P dan gen pengawalseliaan I. Kod gen I ialah protein penindas yang boleh mengikat pada kedudukan O jujukan operator, supaya operon (meta) ditindas dan dimatikan. Terdapat juga tapak pengikatan untuk tapak pengikatan protein pengaktif gen katabolik-CAP di hulu jujukan permulaan P. Jujukan P, jujukan O dan tapak pengikatan CAP bersama-sama membentuk kawasan pengawalseliaan operon lac. Gen pengekodan bagi ketiga-tiga enzim dikawal oleh kawasan pengawalseliaan yang sama untuk mencapai ekspresi produk gen yang diselaraskan.
Sekiranya tiada laktosa, operon lac (meta) berada dalam keadaan penindasan. Pada masa ini, penindas lac yang diekspresikan oleh urutan I di bawah kawalan urutan promoter PI mengikat pada urutan O, yang menghalang RNA polimerase daripada mengikat pada urutan P dan menghalang permulaan transkripsi; apabila laktosa hadir, operon lac (meta) boleh diinduksi. Dalam sistem operon (meta) ini, pendorong sebenar bukanlah laktosa itu sendiri. Laktosa memasuki sel dan dimangkinkan oleh β-galaktosidase untuk ditukar kepada allolaktosa. Yang terakhir, sebagai molekul pendorong, mengikat pada protein penindas dan mengubah konformasi protein, yang membawa kepada penceraian protein penindas daripada urutan O dan transkripsi. Isopropylthiogalactoside (IPTG) mempunyai kesan yang sama seperti allolaktosa. Ia adalah pendorong yang sangat kuat, yang tidak dimetabolismekan oleh bakteria dan sangat stabil, jadi ia digunakan secara meluas di makmal.
Bagaimana untuk menentukan kepekatan IPTG yang optimum? Ambil E. coli sebagai contoh.
Strain E. coli BL21 yang telah direkayasa secara genetik yang mengandungi pGEX rekombinan positif (CGRP/msCT) telah diinokulasi ke dalam medium cecair LB yang mengandungi 50μg·mL-1 Amp, dan dikultur semalaman pada suhu 37°C. Kultur di atas telah diinokulasi ke dalam 10 botol medium cecair LB segar 50mL yang mengandungi 50μg·mL-1 Amp pada nisbah 1:100 untuk kultur pengembangan, dan apabila nilai OD600 ialah 0.6~0.8, IPTG telah ditambah kepada kepekatan akhir. Ia ialah 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Selepas induksi pada suhu dan masa yang sama, 1 mL larutan bakteria diambil daripadanya, dan sel bakteria dikumpulkan melalui sentrifugasi dan tertakluk kepada SDS-PAGE untuk menganalisis pengaruh kepekatan IPTG yang berbeza terhadap ekspresi protein, dan kemudian memilih kepekatan IPTG dengan ekspresi protein terbesar.
Selepas eksperimen, didapati bahawa kepekatan IPTG tidak sebesar mungkin. Ini kerana IPTG mempunyai ketoksikan tertentu terhadap bakteria. Melebihi kepekatan juga akan membunuh sel; dan secara amnya, kita berharap lebih banyak protein larut yang diekspresikan dalam sel, lebih baik, tetapi dalam banyak kes apabila kepekatan IPTG terlalu tinggi, sejumlah besar rangkuman akan terbentuk. Badan, tetapi jumlah protein larut berkurangan. Oleh itu, kepekatan IPTG yang paling sesuai selalunya bukan semakin besar semakin baik, tetapi semakin rendah kepekatannya.
Tujuan induksi dan penanaman strain kejuruteraan genetik adalah untuk meningkatkan hasil protein sasaran dan mengurangkan kos. Ekspresi gen sasaran bukan sahaja dipengaruhi oleh faktor strain itu sendiri dan ekspresi plasmid, tetapi juga oleh keadaan luaran yang lain, seperti kepekatan inducer, suhu induksi dan masa induksi. Oleh itu, secara amnya, sebelum protein yang tidak diketahui diekspresikan dan ditulenkan, adalah lebih baik untuk mengkaji masa induksi, suhu dan kepekatan IPTG untuk memilih keadaan yang sesuai dan mendapatkan keputusan eksperimen yang terbaik.
Masa siaran: 31 Dis-2021